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IL-3 雞白介素3酶聯(lián)免疫試劑盒分光光度法 注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。 試劑一：液體×1瓶，4℃保存。 試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加10mL蒸餾水溶解。 試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑一，沸水溶解。試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50mL蒸餾水溶解。試劑五：液體×1瓶，4℃保存。 標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支，0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪an酸溶液，4℃保存。自備儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5mLEP管和蒸餾水。產(chǎn)品說(shuō)明： NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無(wú)毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn)，中性蛋bai酶常用于食品、飼料、化妝品和營(yíng)養(yǎng)保健品。 中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪an酸；在堿性條件下，酪an酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在680nm有特征吸收峰。

操作過(guò)程：

一、粗酶液提?。?/p>

1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。2.血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。 3.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定操作： 1.分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680nm，蒸餾水調(diào)零。2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。 3.對(duì)照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。 4.測(cè)定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑二，混勻后8000g，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二） 5.空白管：取EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A空白管。 6.標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

NP酶活性計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算 NP活性單位（U）定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol酪an酸為一個(gè)酶活單位。NP活性（U/mgprot）=C標(biāo)準(zhǔn)品×△A測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)×V1÷（Cpr×V2）÷T =0.125×△A測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr 

（2）按樣本鮮重計(jì)算 NP活性單位（U）定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1μmol酪an酸為一個(gè)酶活單位。NP活性（U/g鮮重）=C標(biāo)準(zhǔn)品×△A測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)×V1÷（W×V2÷V3）÷T =0.125×△A測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)÷WC標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)酪an酸溶液濃度，0.25μmol/mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品鮮重，g； V1：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；V2：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，20µL=2×10-2mL；V3：粗酶液總體積，1mL； T：催化反應(yīng)時(shí)間，10min。 注意：若反應(yīng)較弱，（A測(cè)定管－A對(duì)照管）差值較小，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（20-30min），即第一步水浴時(shí)間，最后計(jì)算酶活時(shí)對(duì)公式進(jìn)行修改。

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