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小鼠肝星狀細(xì)胞永生化細(xì)胞專用培養(yǎng)基操作步驟

** 細(xì)胞傳代與凍存**

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)即可進(jìn)行傳代。棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS輕柔洗滌兩次，加入0.25%（含EDTA）消化1-2分鐘。鏡下觀察細(xì)胞變圓后，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打形成單細(xì)胞懸液。離心（1000rpm, 5分鐘）后棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2至1:3比例分瓶培養(yǎng)。

**質(zhì)量控制要點(diǎn)**

* **形態(tài)觀察：** 永生化肝星狀細(xì)胞應(yīng)呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形或多角形，胞質(zhì)豐富，核仁明顯。若出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落或大量空泡，提示培養(yǎng)條件異常。

* **生長(zhǎng)曲線：** 定期繪制生長(zhǎng)曲線，監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖速率。異常增殖或停滯可能表明培養(yǎng)基失效或細(xì)胞污染。

* **功能驗(yàn)證：** 建議定期通過(guò)α-SMA免疫熒光染色或膠原分泌檢測(cè)驗(yàn)證細(xì)胞活化狀態(tài)，確保其保持星狀細(xì)胞特性。

**7. 注意事項(xiàng)**

* **無(wú)菌操作：** 所有操作需在超凈臺(tái)中進(jìn)行，避免污染。

* **培養(yǎng)基保存：** 培養(yǎng)基4℃保存不超過(guò)2周，避免反復(fù)凍融。

* **細(xì)胞狀態(tài)：** 永生化細(xì)胞雖可長(zhǎng)期培養(yǎng)，但建議定期更換新鮮凍存細(xì)胞，避免遺傳漂變。

* **實(shí)驗(yàn)記錄：** 詳細(xì)記錄培養(yǎng)基批次、細(xì)胞代數(shù)和實(shí)驗(yàn)條件，確保實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。

**8. 常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案**

* **細(xì)胞貼壁不良：** 檢查培養(yǎng)瓶是否經(jīng)過(guò)包被，或增加血清濃度至15%。

* **增殖緩慢：** 確認(rèn)培養(yǎng)基新鮮度，或嘗試添加2mM L。

* **污染處理：** 立即丟棄污染細(xì)胞，消毒培養(yǎng)環(huán)境，啟用新批次培養(yǎng)基。

（注：具體操作參數(shù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和細(xì)胞株特性進(jìn)行優(yōu)化。）

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