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細(xì)胞感染有以下三種:
(一)細(xì)胞準(zhǔn)備
將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24孔板,使細(xì)胞濃度為 1×105/ml 細(xì)胞,接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同, 一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于 50%至70%之間。
(二)病毒感染
1.感染細(xì)胞MOI 的測定MOI(Multiplicity of Infection,感染復(fù)數(shù))是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù),通常MOI 越高,病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。對于分裂活躍的細(xì)胞,比如 Hela、293 細(xì)胞,MOI=1~3 時(shí),80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對于非分裂細(xì)胞,比如原代細(xì)胞,感染效率較低。需要進(jìn)行MOI梯度摸索實(shí)驗(yàn),選擇適合的MOI 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.感染步驟
按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板(比如12孔板);細(xì)胞數(shù)以第2天密度約50%為宜;37℃ 培養(yǎng)過夜。
對于Polybrene 可施加的細(xì)胞:準(zhǔn)備*培養(yǎng)基和 Polybrene混合物,Polybrene 終濃度為摸索得到的zui適終濃度。移去培養(yǎng)基并添加 0.5 ml Polybrene/培養(yǎng)基混合物于每孔中(適用于24 孔板,其他孔板請相應(yīng)調(diào)整體)。
對于不適用 Polybrene 的細(xì)胞,以上步驟省略,直接進(jìn)入下面步驟:
感染前,從冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒,吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基,將病毒原液加入細(xì)胞中,輕輕8字混勻。感染后第二天(約12小時(shí)),吸去含病毒的培養(yǎng)液,換上新鮮的*培養(yǎng)液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)。感染后48小時(shí),對于帶 GFP報(bào)告基因的病毒,可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)效率,對于攜帶 Puromycin抗性基因的病毒,換上含適當(dāng)濃度的 Puromycin 的新鮮*培養(yǎng)液,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。