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ELISA試劑盒競爭法的方法學(xué)評價
點(diǎn)擊次數(shù):1132 更新時間:2019-01-18

     當(dāng)ELISA試劑盒競爭法開發(fā)以親和力大小比較為目的,往往會以IC50值評價待測樣品阻斷配體受體結(jié)合效果,IC50越小,待測樣品的阻斷效果越好。親和力競爭法開發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。
   具體到elisa競爭法的方法學(xué)評價,即制備相對于對照品理論效價為156%,125%,,80%,64%的樣品進(jìn)行檢測,通過比較對照品和樣品的IC50,得到樣品相對于實(shí)測效價,通過實(shí)測效價和理論效價的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的elisa競爭法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個濃度點(diǎn),進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示:該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn),得到的實(shí)測效價經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中主要的幾個概念,精密度,準(zhǔn)確度,線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測效價和理論效價的差異在5%以內(nèi),能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的elisa競爭法有較好的方法質(zhì)量。
   當(dāng)elisa競爭法開發(fā)以定量為目的,選取7個點(diǎn)以理論濃度為X軸,信號值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,將對照品的信號值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測濃度值,多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測上限,檢測下限,測量范圍,更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。
   對照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi),回測濃度值和理論濃度的偏差在20%以內(nèi),初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺期的低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺期點(diǎn)會嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。

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